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玉米中伏马毒素B1、B2间接竞争酶联免疫吸附方

作者:

关键词:

摘要：

伏马毒素(fumonisins，FBs)是GELDERBLON等于1988年从串珠镰刀菌的培养液中首次分离出来[1],广泛分布于世界各地，污染各种粮食作物，尤其是玉米及其加工产品。此外，在其他作物或农产品中也检测到FBs污染，例如水稻、面粉、谷物及其制品、干豆、坚果等。FBs分为A、B、C、D四大类，目前已发现的有FA1、FA2、FB1、FB2、FB3、FB4、FC1、FC2、FC3、FC4和FD1，共11种。其中毒性最强的为FB1，在FBs粮食污染中占60%以上[2]，其次为FB2，天然污染的玉米籽粒中被FB1和FB2污染的比例为3∶1[3]。

FBs具有多种毒性，主要包括神经毒性、组织器官毒性、致癌性、免疫毒性、细胞毒性、生殖毒性等[4-6]。据2016年中国饲料和原料霉菌毒素检测报告显示[7]，最近几年全球FBs污染趋势明显升高, 在食品与饲料安全中的危害引发人们的广泛关注[8]。目前，我国对玉米中FBs残留限量标准为 4 mg/kg[9]，欧盟及美国为2 mg/kg[10]，瑞典为1 mg/kg[2]。现有的 FBs检测方法有高效液相色谱-固相荧光法[11]、免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法[12]、高效液相色谱-串联质谱联用法[13]、免疫学检测方法[14]等。这些检测方法需要大型仪器设备及专业操作人员，不便于实际检测中的样品筛查。免疫学检测方法相对简单，尤其是间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay，ic-ELISA)在小分子物质的免疫学检测中应用最为广泛，具有简单、灵敏、高效的优点[15]，适合大量样品的初筛。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

FB1、FB2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、T-2毒素、黄曲霉素B1(aflatoxin B1，AFB1)，青岛Pribolab生物工程有限公司；FB1单克隆抗体为本实验室自制[16]；吐温-20，美国Amresco公司；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)标记羊抗小鼠 IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司；牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)，生工生物工程(上海)有限公司；四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)，北京梅科万德生物科技有限公司；酶标板，广州洁特生物过滤制品有限公司。

酶标仪，瑞士TECAN公司；电子天平，德国赛多利斯集团；高速低温冷冻离心机(Biofuge Primo R)，美国Thermo Fisher科技公司；酶标板振荡器(MTS2/4)、高速匀浆机(ULTRA-TURRAX T-10 basF)，德国IKA；-80 ℃超低温冰箱，三洋电器；恒温培养箱(DHP-120)，上海实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 ic-ELISA条件优化

抗原BSA-FB1梯度稀释为2、1、0.5、0.25、1.25、0.062 5 mg/L。单抗体分别稀释为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/L。通过ic-ELISA方法确定抗原和单抗体的最佳使用质量浓度。

根据上述优化条件，在相同反应条件下，分别进行包被条件(4 ℃ 12 h、4 ℃ 24 h、37 ℃ 4 h、37 ℃ 2 h、37 ℃ 1 h)，酶标二抗稀释倍数(1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000)和底物作用时间(5、10、15、20、25、30 min)3组ic-ELISA实验，比较不同条件的P/N (阳性孔OD450nm值/空白孔OD450 nm值)，选择最大值以确定检抗原包被条件、酶标二抗稀释倍数、底物作用时间。

1.2.2 标准曲线的建立

将8个质量浓度的FB1溶液(100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0 μg/L)，每个质量浓度重复5孔，按照ic-ELISA法测定获得相应的OD450 nm，以抑制率为纵坐标，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，绘制标准曲线。抑制率按公式(1)计算：

抑制率

式中：A0，标准品0 ng/mL的吸光度值；A，标准品不同质量浓度的吸光度值。

1.2.3 特异性验证

为验证建立的方法特异性，选FB1、FB2、DON、ZEA、T-2、AFB1六种真菌毒素做交叉反应试验。交叉反应率按公式(2)计算:

交叉反应率

1.2.4 加标回收

将磨细的玉米样品1 g加至5 mL 体积分数为70%的甲醇缓冲液中，超声10 min后将固液混合物4 000×g离心5 min。取上清液用磷酸缓冲盐溶液10倍稀释用于ic-ELISA。设定FBs(按FB1与FB2总量计，FB1与FB2质量比为3∶1)加标质量分数分别为2、1、0.25 g/kg，每个质量分数做3个重复，按公式(3)计算回收率[17-18]。

回收率

2 结果与分析

2.1 抗原包被和单抗体质量浓度的确定

ic-ELISA检测方法结果见表1。OD值是1左右相对应的质量浓度为抗原、抗体最佳使用质量浓度[15]，选择抗原包被质量浓度为0.5 mg/L，抗体质量浓度为0.2 mg/L。

表1 包被抗原、抗体最佳用量的确定Table 1 The optimal amount of coating antigen and antibody单抗体质量浓度/(mg·L-1)抗原包被质量浓度/(mg·L-1) .

文章来源：《玉米科学》网址: http://www.ymkxzz.cn/qikandaodu/2021/0119/678.html